Categoria farmacoterapeutica: altri agenti diagnostici, codice ATC: V04CX.
Per la quantità di 75 mg di urea l3 C, somministrata per unità nel corso del test dell'espirato, non è stata descritta alcuna attività farmacodinamica.
Dopo l'assunzione orale, l'urea marcata raggiunge la mucosa gastrica. In presenza di Helicobacter pylori, l'urea 13 C viene metabolizzata dall'enzima ureasi dell'Helicobacter pylori.
2H2 N(13 CO)NH2 + 2H2 O ------ enzima ureasi -----> 4 NH3 + 213 CO2
Il biossido di carbonio si diffonde nei vasi sanguigni. Da lì è trasportato, sotto forma di bicarbonato, nei polmoni e liberato come 13 CO2 con l'aria espirata.
In presenza di ureasi batterica il rapporto degli isotopi di carbonio 13 C/12 C viene a modificarsi in modo significativo. La componente 13 CO2 nei campioni di espirato viene determinata tramite spettrometria di massa basata sul rapporto degli isotopi (isotope-ratio-mass-spectrometry - IRMS) ed espressa come differenza assoluta (valore Dd) tra il valore al tempo 00-minuti e il valore a 30-minuti.
L'ureasi è prodotta nello stomaco solamente dall'Helicobacter pylori. Raramente nella flora batterica gastrica sono stati trovati altri batteri produttori di ureasi.
Il punto di discriminazione tra i pazienti negativi all'Helicobacter pylori e quelli positivi è stabilito essere un valore Dd del 4ä; ciò significa che un incremento maggiore di 4ä del valore Dd sta ad indicare un'infezione. In confronto con una diagnostica di un'infezione da Helicobacter pylori basata sulla biopsia, il test dell'espirato raggiunge, in studi clinici su 457 pazienti, una sensibilità compresa in un intervallo tra 96,5% e 97,9% [95%-CI: 94,05% - 99,72%] ed una specificità compresa tra 96,7% e 100% [95%-CI: 94,17% - 103,63%].
In assenza di ureasi batterica l'intera quantità di urea somministrata, dopo il riassorbimento nel tratto gastrointestinale, viene metabolizzata come l'urea endogena. L'ammoniaca, che si forma dall'idrolisi batterica sopra descritta, entra nel ciclo metabolico sotto forma di NH4 + .
1. Il test deve essere eseguito in presenza di una persona qualificata.
2. Ogni paziente deve essere documentato in accordo con la scheda acclusa. Si raccomanda di eseguire il test con il paziente in posizione di riposo.
3. Il test comincia con la raccolta di campioni per la determinazione del valore basale (valore-00-minuti):
Prendere dalla confezione per il test la cannuccia ed entrambe le provette con l'etichetta: "Tempo di campionamento: valore-00-minuti".Rimuovere il tappo da una delle provette, liberare la cannuccia e inserirla nella provetta.Espirare ora lentamente attraverso la cannuccia finché la superficie interna della provetta si appanna.Continuando ad espirare, si deve estrarre la cannuccia e chiudere immediatamente la provetta con il suo tappo.
(Se la provetta di campionamento rimane aperta per più di 30 secondi, il risultato del test potrebbe essere alterato).
Tenere la provetta verticale e attaccare l'etichetta con codice a barre contrassegnata "valore-00-minuti" attorno alla provetta in modo che le linee del codice a barre siano orizzontali.
4. Riempire la seconda provetta (Etichettata: "Tempo di campionamento: valore-00-minuti") con l'espirato, seguendo lo stesso procedimento.
5. Si devono ora bere senza indugio 200 ml di succo d'arancia al 100%.
6. Ora segue la preparazione della soluzione test:
Il flacone etichettato "urea 13 C polvere" viene estratto dalla confezione del test, aperto e riempito con acqua fino a tre quarti del suo volume.Chiudere il flacone e agitare accuratamente fino a quando tutta la polvere non è sciolta. Versare il contenuto in un bicchiere.Riempire il flacone di urea 13 C con acqua fino all'orlo per una seconda e terza volta e aggiungere questi contenuti nel bicchiere (il volume totale di acqua dovrebbe essere circa 30 ml).
7. Questa soluzione test deve ora essere bevuta dal paziente immediatamente e l'ora di ingestione deve essere annotata.
8. Trenta minuti dopo la somministrazione della soluzione test (punto 7), raccogliere i campioni "valore-30-minuti" in entrambe le provette rimaste nella confezione del test (Etichettate: "Tempo di campionamento: valore-30-minuti"), come descritto nei punti 3 e 4.
Usare per questi campioni le etichette con codice a barre contrassegnate "valore-30-minuti".
9. Mettere le relative etichette con il codice a barre sulla scheda per la documentazione del paziente. Sigillare infine la confezione con l'adesivo.
10. I contenitori dei campioni devono essere inviati nel confezionamento originale a un laboratorio qualificato, per l'analisi.
Analisi dei campioni di espirato e specifiche analitiche
I campioni di espirato, raccolti in provette da 10 ml, in vetro od in plastica, vengono analizzati per mezzo della spettrometria di massa basata sul rapporto tra isotopi (IRMS).
L'analisi del rapporto 13 C/12 C nel biossido di carbonio dell'espirato è una parte integrante del kit diagnostico Helicobacter Test INFAI. L'accuratezza del test dipende decisamente dalla qualità dell'analisi dell'espirato. Le specifiche dei parametri dello spettrometro di massa quali linearità, stabilità (precisione del gas di riferimento) e precisione della misurazione sono fondamentali per l'accuratezza del sistema.
Si deve garantire che l'analisi sia eseguita da laboratori qualificati. Il metodo validato per l'analisi è il seguente:
- Preparazione del campione
Per determinare il rapporto 13 C/12 C di biossido di carbonio nell'espirato per mezzo della spettrometria di massa, il biossido di carbonio deve essere separato dall'espirato ed introdotto nello spettrometro di massa. Il sistema di preparazione automatica per spettrometri di massa isotopici che è dedicato all'analisi del test dell'espirato, si basa su una tecnica di separazione gascromatografica a flusso continuo.
L'acqua viene rimossa dal campione per mezzo di una trappola di Nafion o del sistema gascromatografico di preparazione che separa i singoli gas in una colonna gascromatografica, con elio come eluente. All'uscita della colonna, i gas dell'espirato separati vengono rivelati da un rivelatore a ionizzazione. La frazione di gas biossido di carbonio, identificata dal suo caratteristico tempo di ritenzione, viene introdotta nello spettrometro di massa.
- Analisi tramite spettrometria di massa
Per analizzare nel campione gassoso il biossido di carbonio, le sue molecole separate devono essere ionizzate, trasformate in un fascio, accelerate da un campo elettrico, deflesse in un campo magnetico ed infine rilevate. Questi cinque processi hanno luogo nell'analizzatore di uno spettrometro di massa che è costituito da tre sezioni separate: la sorgente, il tubo di volo e il collettore. Ionizzazione, formazione del fascio e accelerazione si verificano tutte nella sorgente, la deflessione magnetica avviene nel tubo di volo e la rivelazione ha luogo nel collettore.
- Introduzione del campione
Per l'introduzione del biossido di carbonio nell'analizzatore sono disponibili molti sistemi di inserimento del campione. Per l'analisi del test dell'espirato è essenziale il singolo bilanciamento del biossido di carbonio del campione rispetto a un gas, che funge da standard di riferimento. Questo garantisce un'elevata accuratezza del sistema, poiché il calcolo del contenuto isotopico nel biossido di carbonio viene fatto in confronto con uno standard indipendente.
- Specifiche per la determinazione del rapporto 13 C/12 C
Il principio del test dell'espirato si fonda sulla somministrazione di una urea specificatamente marcata 13 C, la cui utilizzazione come metabolita viene seguita misurando la 13 CO2 nel gas espirato.
Lo spettrometro di massa deve essere in grado di:
Analisi multiple replicate: minimo 3 replicazioni dell'analisi sullo stesso campione durante l'operazione
Accesso di sicurezza: memorizzazione dei parametri operativi e dei risultati sotto accesso di sicurezza per evitare successive manipolazioni
Aggiustamento: rapporto 13 C/12 C rispetto a PDB (Pee Dee Beliminate)
Loop del campione: < 200 ml.
I test fondamentali per verificare le specifiche sono linearità, stabilità (precisione del gas di riferimento) e precisione della misurazione.
Tutti gli spettrometri di massa per l'analisi dell'espirato devono soddisfare le seguenti specifiche:
Linearità: